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引言

過氧化氫參與細(xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)，對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)和生理過程至關(guān)重要，在單細(xì)胞水平上定性識(shí)別、定量表征過氧化氫可更全面揭示異質(zhì)性細(xì)胞特征，促進(jìn)疾病檢測(cè)和藥物篩選的發(fā)展。單細(xì)胞由于其結(jié)構(gòu)多樣性、快速代謝物動(dòng)力學(xué)特征和難以預(yù)測(cè)的信號(hào)放大等因素影響，活體單細(xì)胞檢測(cè)仍非常具有挑戰(zhàn)性。SERS技術(shù)具備非侵入性、低自發(fā)熒光、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，已成為檢測(cè)分析細(xì)胞代謝產(chǎn)物的前景技術(shù)，可用于核酸、氨基酸、脂質(zhì)、葡萄糖、神經(jīng)遞質(zhì)等體系研究。然而，由于基底不可逆聚集和靶生物分子的非特異性吸附等因素影響，SERS技術(shù)仍有低重復(fù)性、低再現(xiàn)性等缺點(diǎn)。同時(shí)由于普通光學(xué)顯微鏡難以定位追蹤待測(cè)物，SERS技術(shù)在復(fù)雜生物體系應(yīng)用仍受很大限制。在這方面，暗場(chǎng)顯微鏡采用特殊的照明方式，只允許樣品散射的信號(hào)進(jìn)入物鏡內(nèi)，可克服常規(guī)光學(xué)顯微針對(duì)均一樣品中的微小結(jié)構(gòu)成像時(shí)，透射或反射襯度不足的問題，利用這個(gè)方法可以看見突破衍射極限的微粒子。暗場(chǎng)散射和SERS技術(shù)相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)活細(xì)胞中代謝物檢測(cè)。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組在Au納米粒子上覆蓋二維共價(jià)有機(jī)框架（COFs）構(gòu)建尺寸可控、富集力強(qiáng)、穩(wěn)定性高和生物相容性更好的核殼結(jié)構(gòu)(Au@COF)生物傳感器。并用拉曼光譜/暗場(chǎng)散射成像雙模技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中過氧化氫代謝物水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該生物納米傳感器簡(jiǎn)單、高效，可實(shí)現(xiàn)過氧化氫和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的在線檢測(cè)。本研究為開發(fā)基于COF的SERS生物傳感平臺(tái)提供了實(shí)驗(yàn)思路，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物相關(guān)疾病早期診斷提供一種有效方法。

結(jié)果分析

本文通過在Au納米粒子上覆蓋二維共價(jià)有機(jī)框架（COFs），COFs殼層結(jié)構(gòu)均勻包裹Au納米粒子，提高基底穩(wěn)定性；納米級(jí)多孔結(jié)構(gòu)有效富集生物分子，提高分子濃度和靈敏度；多孔COFs層可消除不均勻分子吸附，使基底具備高穩(wěn)定性和高抗干擾性，此外，COFs具有良好生物相容性。利用SERS/暗場(chǎng)散射雙模檢測(cè)技術(shù)，有效定位追蹤單個(gè)細(xì)胞靶向微區(qū)，實(shí)現(xiàn)原位監(jiān)測(cè)細(xì)胞中H₂O₂代謝產(chǎn)物。

圖1 Au@COF納米傳感器合成示意圖、拉曼光譜圖和暗場(chǎng)顯微圖像

圖2（A）Au@COF/MPBA納米傳感器感應(yīng)機(jī)制。（B） MPBA、MPBA與H2O2和HBT的拉曼光譜。（C） Au@COF/MPBA被不同氧化后的拉曼光譜圖（D） Au@COF/MPBA被不同氧化后的I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強(qiáng)度比，Au@COFn濃度為0.5 nM

圖3 （A） 不同H₂O₂濃度下， B-O-H變形振動(dòng)的1023 cm^?1拉曼峰；（B）I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強(qiáng)度比與H₂O₂濃度函數(shù)關(guān)系（C）I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強(qiáng)度比率與時(shí)間變化關(guān)系，Au@COF為0.5nM

圖4（A） COF外殼保護(hù)作用示意圖，COF外殼阻擋大分子進(jìn)入；（B）細(xì)胞培養(yǎng)基中不同H₂O₂濃度下Au@COF/MPBA的拉曼光譜圖；（C-D）細(xì)胞培養(yǎng)基和BSA溶液中，I₁₀₇₅/I₁₀₂₃拉曼峰強(qiáng)度比與H₂O₂濃度函數(shù)關(guān)系，Au@COF為0.5nM。

圖5 Au@COF/MPBA納米傳感器用于細(xì)胞內(nèi)成像；（A）共焦顯微鏡檢測(cè)光路示意圖；（B） MCF-7細(xì)胞在Au@COF/MPBA孵育后的明場(chǎng)、暗場(chǎng)圖像；(C-D)不同采樣點(diǎn)的拉曼光譜圖，1-3采樣點(diǎn)在1023和1075cm^-1有拉曼峰，Au@COF濃度為0.25nM。

圖6 細(xì)胞內(nèi)不同藥物處理后H₂O₂的成像圖；(A)未處理的細(xì)胞,(B)2 mg·mL^?1的NAC，（C）1 mM PMA和（D）200 mM H₂O₂；從左到右依次為明場(chǎng)（BF）圖像、暗場(chǎng)（DF）圖像、拉曼Mapping圖像和合成圖像。紅色圖為1075 cm^?1拉曼峰Mapping圖，紅色圖為1023 cm^?1拉曼峰Mapping圖。Au@COF濃度為0.5nM。

結(jié)論

在本文中，王琛教授課題組設(shè)計(jì)一款高穩(wěn)定性、尺寸可控、富集力強(qiáng)和生物相容性高的核殼結(jié)構(gòu)Au@COF納米生物傳感器。采用拉曼光譜/暗場(chǎng)散射成像雙模技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中過氧化氫代謝物水平。盡管目前納米傳感器仍處于起步階段，Au@COF納米傳感器由于COF外殼吸附效應(yīng)和Au核LSPR效應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)不同探針分子類型，為活細(xì)胞代謝物檢測(cè)提供一種前途策略。

南京師范大學(xué)王琛教授課題組簡(jiǎn)介

王琛，南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者（2020年），江蘇省“青藍(lán)工程"優(yōu)秀青年骨干教師、中青年學(xué)術(shù)帶頭人；南京師范大學(xué)本科、碩士，2011年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生命分析國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2012-2016南京大學(xué)從事物理學(xué)博士后，2016-2017年麻省理工學(xué)院（MIT，美國）訪問學(xué)者。至今，在Angew. Chem. Int. Ed., Sci. China Chem., Nano lett., ACS Nano, Anal. Chem.等學(xué)術(shù)期刊發(fā)表研究論文60 余篇；參編英文圖書 《Nanobiosensors: From Design to Applications》(Wiley)；主持多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)、江蘇省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目；擔(dān)任Chinese Chemical Letters期刊編委，中國分析測(cè)試協(xié)會(huì)青年學(xué)術(shù)委員會(huì)委員，江蘇省材料學(xué)會(huì)副秘書長。

文章信息

本文以“SERS and dark-field scattering dual-mode detection of intracellular hydrogen peroxide using biocompatible Au@COF nanosensor"為題發(fā)表在Sensors and Actuators: B. Chemical期刊上。南京師范大學(xué)王琛老師為通訊作者。

本研究暗場(chǎng)顯微圖像和拉曼光譜數(shù)據(jù)使用的是北京卓立漢光儀器有限公司RTS2 多功能激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，如需了解該產(chǎn)品，歡迎咨詢。

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